माइक्रोबियल मेटाप्रोटोमिक्स: नमूना प्रशोधनबाट, डेटा संकलनबाट डेटा विश्लेषणसम्म

वु एनहुई, किओ लिआंग*

रसायन विज्ञान विभाग, फुदान विश्वविद्यालय, शाङ्घाई 200433, चीन

सूक्ष्मजीवहरू मानव रोग र स्वास्थ्यसँग नजिकबाट सम्बन्धित छन्। माइक्रोबियल समुदायहरूको संरचना र तिनीहरूका कार्यहरू कसरी बुझ्ने यो एक प्रमुख मुद्दा हो जुन तुरुन्तै अध्ययन गर्न आवश्यक छ। हालका वर्षहरूमा, मेटाप्रोटोमिक्स सूक्ष्मजीवहरूको संरचना र कार्य अध्ययन गर्न महत्त्वपूर्ण प्राविधिक माध्यम भएको छ। यद्यपि, जटिलता र माइक्रोबियल सामुदायिक नमूनाहरूको उच्च विविधताका कारण, नमूना प्रशोधन, मास स्पेक्ट्रोमेट्री डाटा अधिग्रहण र डाटा विश्लेषण मेटाप्रोटोमिक्सले सामना गर्ने तीन प्रमुख चुनौतीहरू बनेका छन्। मेटाप्रोटियोमिक्स विश्लेषणमा, विभिन्न प्रकारका नमूनाहरूको पूर्व-उपचारलाई अनुकूलन गर्न र विभिन्न माइक्रोबियल विभाजन, संवर्धन, निकासी र लिसिस योजनाहरू अपनाउन अक्सर आवश्यक हुन्छ। एकल प्रजातिको प्रोटोम जस्तै, मेटाप्रोटोमिक्समा मास स्पेक्ट्रोमेट्री डाटा अधिग्रहण मोडहरूमा डाटा-निर्भर अधिग्रहण (DDA) मोड र डाटा-स्वतन्त्र अधिग्रहण (DIA) मोड समावेश छ। DIA डाटा अधिग्रहण मोडले नमूनाको पेप्टाइड जानकारी पूर्ण रूपमा सङ्कलन गर्न सक्छ र ठूलो विकास क्षमता छ। यद्यपि, मेटाप्रोटोम नमूनाहरूको जटिलताको कारण, यसको DIA डेटा विश्लेषण एक प्रमुख समस्या भएको छ जसले मेटाप्रोटोमिक्सको गहिरो कभरेजमा बाधा पुर्‍याउँछ। डाटा विश्लेषणको सन्दर्भमा, सबैभन्दा महत्त्वपूर्ण चरण प्रोटीन अनुक्रम डाटाबेसको निर्माण हो। डाटाबेसको आकार र पूर्णताले पहिचानको संख्यामा मात्र ठूलो प्रभाव पार्दैन, तर प्रजाति र कार्यात्मक स्तरहरूमा विश्लेषणलाई पनि असर गर्छ। वर्तमानमा, मेटाप्रोटोम डाटाबेसको निर्माणको लागि सुनको मानक मेटाजेनोममा आधारित प्रोटीन अनुक्रम डाटाबेस हो। एकै समयमा, पुनरावृत्ति खोजमा आधारित सार्वजनिक डाटाबेस फिल्टरिङ विधि पनि बलियो व्यावहारिक मूल्य भएको प्रमाणित भएको छ। विशिष्ट डेटा विश्लेषण रणनीतिहरूको परिप्रेक्ष्यबाट, पेप्टाइड-केन्द्रित DIA डेटा विश्लेषण विधिहरूले पूर्ण मुख्यधारा ओगटेको छ। गहिरो शिक्षा र कृत्रिम बुद्धिमत्ताको विकासको साथ, यसले म्याक्रोप्रोटोमिक डेटा विश्लेषणको शुद्धता, कभरेज र विश्लेषण गतिलाई धेरै बढावा दिनेछ। डाउनस्ट्रीम बायोइन्फर्मेटिक्स विश्लेषणको सन्दर्भमा, हालका वर्षहरूमा एनोटेशन उपकरणहरूको एक श्रृंखला विकसित गरिएको छ, जसले माइक्रोबियल समुदायहरूको संरचना प्राप्त गर्न प्रोटीन स्तर, पेप्टाइड स्तर र जीन स्तरमा प्रजाति एनोटेसन गर्न सक्छ। अन्य ओमिक्स विधिहरूको तुलनामा, माइक्रोबियल समुदायहरूको कार्यात्मक विश्लेषण म्याक्रोप्रोटोमिक्सको एक अद्वितीय विशेषता हो। म्याक्रोप्रोटोमिक्स माइक्रोबियल समुदायहरूको बहु-ओमिक्स विश्लेषणको महत्त्वपूर्ण भाग भएको छ, र अझै पनि कभरेज गहिराइ, पत्ता लगाउने संवेदनशीलता, र डेटा विश्लेषण पूर्णताको सन्दर्भमा ठूलो विकास क्षमता छ।

01 नमूना पूर्व उपचार

हाल, मेटाप्रोटोमिक्स प्रविधि मानव माइक्रोबायोम, माटो, खाना, महासागर, सक्रिय स्लज र अन्य क्षेत्रहरूको अनुसन्धानमा व्यापक रूपमा प्रयोग गरिएको छ। एकल प्रजातिको प्रोटोम विश्लेषणको तुलनामा, जटिल नमूनाहरूको मेटाप्रोटोमको नमूना पूर्व-उपचारले थप चुनौतीहरूको सामना गर्दछ। वास्तविक नमूनाहरूमा माइक्रोबियल संरचना जटिल छ, प्रचुरताको गतिशील दायरा ठूलो छ, विभिन्न प्रकारका सूक्ष्मजीवहरूको सेल पर्खाल संरचना धेरै फरक छ, र नमूनाहरूमा प्रायः होस्ट प्रोटीन र अन्य अशुद्धताहरूको ठूलो मात्रा हुन्छ। तसर्थ, मेटाप्रोटोमको विश्लेषणमा, विभिन्न प्रकारका नमूनाहरू अप्टिमाइज गर्न र विभिन्न माइक्रोबियल विभाजन, संवर्धन, निकासी र लिसिस योजनाहरू अपनाउन अक्सर आवश्यक हुन्छ।

विभिन्न नमूनाहरूबाट माइक्रोबियल मेटाप्रोटोमहरूको निकासीमा केही समानताहरू र केही भिन्नताहरू छन्, तर हाल विभिन्न प्रकारका मेटाप्रोटोम नमूनाहरूको लागि एकीकृत पूर्व-प्रशोधन प्रक्रियाको अभाव छ।

02 मास स्पेक्ट्रोमेट्री डाटा अधिग्रहण

शटगन प्रोटोम विश्लेषणमा, प्रिट्रीटमेन्ट पछि पेप्टाइड मिश्रणलाई पहिले क्रोमेटोग्राफिक स्तम्भमा अलग गरिन्छ, र त्यसपछि आयनीकरण पछि डाटा अधिग्रहणको लागि मास स्पेक्ट्रोमिटरमा प्रवेश गर्दछ। एकल प्रजाति प्रोटोम विश्लेषण जस्तै, म्याक्रोप्रोटोम विश्लेषण मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री डाटा अधिग्रहण मोड DDA मोड र DIA मोड समावेश गर्दछ।

मास स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरणहरूको निरन्तर पुनरावृत्ति र अद्यावधिकको साथ, उच्च संवेदनशीलता र रिजोल्युसनको साथ मास स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरणहरू मेटाप्रोटोममा लागू गरिन्छ, र मेटाप्रोटोम विश्लेषणको कभरेज गहिराइ पनि लगातार सुधारिएको छ। लामो समयको लागि, अर्बिट्रापको नेतृत्वमा उच्च-रिजोल्युसन मास स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरणहरूको श्रृंखला मेटाप्रोटोममा व्यापक रूपमा प्रयोग भइरहेको छ।

मूल पाठको तालिका 1 ले नमूना प्रकार, विश्लेषण रणनीति, मास स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरण, अधिग्रहण विधि, विश्लेषण सफ्टवेयर, र पहिचानहरूको संख्याको सन्दर्भमा 2011 देखि हालसम्म मेटाप्रोटोमिक्समा केही प्रतिनिधि अध्ययनहरू देखाउँदछ।

03 मास स्पेक्ट्रोमेट्री डाटा विश्लेषण

3.1 DDA डाटा विश्लेषण रणनीति

3.1.1 डाटाबेस खोज

३.१.२नयाँअनुक्रम रणनीति

3.2 DIA डाटा विश्लेषण रणनीति

04 प्रजाति वर्गीकरण र कार्यात्मक एनोटेशन

विभिन्न वर्गीकरण स्तरहरूमा माइक्रोबियल समुदायहरूको संरचना माइक्रोबायोम अनुसन्धानको प्रमुख अनुसन्धान क्षेत्रहरू मध्ये एक हो। हालका वर्षहरूमा, माइक्रोबियल समुदायहरूको संरचना प्राप्त गर्न प्रोटीन स्तर, पेप्टाइड स्तर र जीन स्तरमा प्रजातिहरू एनोटेट गर्न एनोटेसन उपकरणहरूको एक श्रृंखला विकसित गरिएको छ।

कार्यात्मक एनोटेशन को सार कार्यात्मक प्रोटीन अनुक्रम डेटाबेस संग लक्ष्य प्रोटीन अनुक्रम तुलना गर्न को लागी छ। जीन प्रकार्य डाटाबेसहरू जस्तै GO, COG, KEGG, eggNOG, इत्यादि प्रयोग गरेर, विभिन्न कार्यात्मक एनोटेशन विश्लेषणहरू म्याक्रोप्रोटोमहरू द्वारा पहिचान गरिएका प्रोटिनहरूमा प्रदर्शन गर्न सकिन्छ। एनोटेसन उपकरणहरूमा Blast2GO, DAVID, KOBAS, आदि समावेश छन्।

05 सारांश र आउटलुक

सूक्ष्मजीवहरूले मानव स्वास्थ्य र रोगमा महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छन्। हालका वर्षहरूमा, मेटाप्रोटोमिक्स सूक्ष्मजीव समुदायहरूको कार्य अध्ययन गर्न महत्त्वपूर्ण प्राविधिक माध्यम भएको छ। मेटाप्रोटियोमिक्सको विश्लेषणात्मक प्रक्रिया एकल-प्रजाति प्रोटियोमिक्ससँग मिल्दोजुल्दो छ, तर मेटाप्रोटियोमिक्सको अनुसन्धान वस्तुको जटिलताको कारण, नमूना पूर्व उपचार, डेटा अधिग्रहणदेखि डाटा विश्लेषणसम्म प्रत्येक विश्लेषण चरणमा विशिष्ट अनुसन्धान रणनीतिहरू अपनाउनुपर्छ। वर्तमानमा, प्रिट्रीटमेन्ट विधिहरूको सुधारको लागि धन्यवाद, मास स्पेक्ट्रोमेट्री टेक्नोलोजीको निरन्तर आविष्कार र बायोइन्फर्मेटिक्सको द्रुत विकास, मेटाप्रोटोमिक्सले पहिचानको गहिराइ र अनुप्रयोग दायरामा ठूलो प्रगति गरेको छ।

म्याक्रोप्रोटोम नमूनाहरूको पूर्व-उपचारको प्रक्रियामा, नमूनाको प्रकृतिलाई पहिले विचार गर्नुपर्छ। वातावरणीय कोशिकाहरू र प्रोटीनहरूबाट सूक्ष्मजीवहरूलाई कसरी अलग गर्ने म्याक्रोप्रोटोमहरू सामना गर्ने प्रमुख चुनौतीहरू मध्ये एक हो, र विभाजन दक्षता र माइक्रोबियल हानि बीचको सन्तुलन समाधान गर्न तत्काल समस्या हो। दोस्रो, सूक्ष्मजीवहरूको प्रोटीन निकासीले विभिन्न ब्याक्टेरियाहरूको संरचनात्मक विषमताको कारणले गर्दा भिन्नताहरूलाई ध्यानमा राख्नुपर्छ। ट्रेस दायरामा म्याक्रोप्रोटोम नमूनाहरू पनि विशिष्ट पूर्व-उपचार विधिहरू चाहिन्छ।

मास स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरणहरूको सन्दर्भमा, मुख्यधारा मास स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरणहरूले मास स्पेक्ट्रोमिटरहरूबाट ओर्बिट्राप मास विश्लेषकहरू जस्तै LTQ-Orbitrap र Q Exactive मास स्पेक्ट्रोमिटरहरूमा आयन गतिशीलता युग्मित समय-अफ-उडान मास विश्लेषकहरू जस्तै timsTOF Pro मा आधारित संक्रमण पार गरेको छ। । आयन गतिशीलता आयाम जानकारीको साथ उपकरणहरूको timsTOF श्रृंखला उच्च पहिचान शुद्धता, कम पत्ता लगाउने सीमा, र राम्रो दोहोर्याउने योग्यता छ। तिनीहरू बिस्तारै विभिन्न अनुसन्धान क्षेत्रहरूमा महत्त्वपूर्ण उपकरणहरू भएका छन् जसलाई मास स्पेक्ट्रोमेट्री पत्ता लगाउन आवश्यक छ, जस्तै प्रोटोम, मेटाप्रोटोम, र एकल प्रजातिको मेटाबोलोम। यो ध्यान दिन लायक छ कि लामो समयको लागि, मास स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरणहरूको गतिशील दायराले मेटाप्रोटोम अनुसन्धानको प्रोटीन कभरेज गहिराइलाई सीमित गरेको छ। भविष्यमा, ठूलो गतिशील दायराको साथ मास स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरणहरूले मेटाप्रोटोमहरूमा प्रोटीन पहिचानको संवेदनशीलता र शुद्धता सुधार गर्न सक्छ।

मास स्पेक्ट्रोमेट्री डाटा अधिग्रहणको लागि, यद्यपि DIA डाटा अधिग्रहण मोडलाई एकल प्रजातिको प्रोटोममा व्यापक रूपमा अपनाइएको छ, हालको म्याक्रोप्रोटोम विश्लेषणहरूले अझै पनि DDA डाटा अधिग्रहण मोड प्रयोग गर्दछ। DIA डाटा अधिग्रहण मोडले नमूनाको टुक्रा आयन जानकारी पूर्ण रूपमा प्राप्त गर्न सक्छ, र DDA डाटा अधिग्रहण मोडको तुलनामा, यसमा म्याक्रोप्रोटोम नमूनाको पेप्टाइड जानकारी पूर्ण रूपमा प्राप्त गर्ने क्षमता छ। यद्यपि, DIA डाटाको उच्च जटिलताका कारण, DIA म्याक्रोप्रोटोम डाटाको विश्लेषणले अझै ठूलो कठिनाइहरूको सामना गरिरहेको छ। कृत्रिम बुद्धिमत्ता र गहिरो शिक्षाको विकासले DIA डेटा विश्लेषणको शुद्धता र पूर्णतामा सुधार गर्ने अपेक्षा गरिएको छ।

मेटाप्रोटियोमिक्सको डेटा विश्लेषणमा, मुख्य चरणहरू मध्ये एक प्रोटीन अनुक्रम डाटाबेसको निर्माण हो। आन्द्राको वनस्पति जस्ता लोकप्रिय अनुसन्धान क्षेत्रहरूको लागि, IGC र HMP जस्ता आन्द्राको माइक्रोबियल डाटाबेसहरू प्रयोग गर्न सकिन्छ, र राम्रो पहिचान परिणामहरू प्राप्त भएका छन्। धेरै अन्य मेटाप्रोटोमिक्स विश्लेषणहरूको लागि, सबैभन्दा प्रभावकारी डाटाबेस निर्माण रणनीति अझै पनि मेटाजेनोमिक अनुक्रमण डेटामा आधारित नमूना-विशिष्ट प्रोटीन अनुक्रम डेटाबेस स्थापना गर्न हो। उच्च जटिलता र ठूला गतिशील दायरा भएका माइक्रोबियल सामुदायिक नमूनाहरूको लागि, कम-प्रचुर प्रजातिहरूको पहिचान बढाउन अनुक्रमण गहिराइ बढाउन आवश्यक छ, जसले प्रोटीन अनुक्रम डाटाबेसको कभरेज सुधार गर्दछ। जब अनुक्रमण डेटा अभाव छ, एक पुनरावृत्ति खोज विधि सार्वजनिक डाटाबेस अनुकूलन गर्न प्रयोग गर्न सकिन्छ। यद्यपि, पुनरावृत्ति खोजले FDR गुणस्तर नियन्त्रणलाई असर गर्न सक्छ, त्यसैले खोज परिणामहरू सावधानीपूर्वक जाँच गर्न आवश्यक छ। थप रूपमा, मेटाप्रोटोमिक्स विश्लेषणमा परम्परागत FDR गुणस्तर नियन्त्रण मोडेलहरूको प्रयोज्यता अझै पनि अन्वेषण गर्न लायक छ। खोज रणनीतिको सन्दर्भमा, हाइब्रिड स्पेक्ट्रल पुस्तकालय रणनीतिले DIA मेटाप्रोटोमिक्सको कभरेज गहिराइ सुधार गर्न सक्छ। हालका वर्षहरूमा, गहिरो सिकाइको आधारमा उत्पन्न गरिएको भविष्यवाणी गरिएको स्पेक्ट्रल पुस्तकालयले DIA प्रोटोमिक्समा उत्कृष्ट प्रदर्शन देखाएको छ। जे होस्, मेटाप्रोटोम डाटाबेसहरूमा प्राय: लाखौं प्रोटीन प्रविष्टिहरू हुन्छन्, जसले भविष्यवाणी गरिएको स्पेक्ट्रल पुस्तकालयहरूको ठूलो मात्रामा परिणाम दिन्छ, धेरै कम्प्युटिङ स्रोतहरू खपत गर्दछ, र ठूलो खोज स्थानमा परिणाम दिन्छ। थप रूपमा, मेटाप्रोटोमहरूमा प्रोटीन अनुक्रमहरू बीचको समानता धेरै भिन्न हुन्छ, यसले स्पेक्ट्रल पुस्तकालय भविष्यवाणी मोडेलको शुद्धता सुनिश्चित गर्न गाह्रो बनाउँछ, त्यसैले भविष्यवाणी गरिएको स्पेक्ट्रल पुस्तकालयहरू मेटाप्रोटोमिक्समा व्यापक रूपमा प्रयोग गरिएको छैन। थप रूपमा, उच्च अनुक्रम-समान प्रोटीनहरूको मेटाप्रोटोमिक्स विश्लेषणमा लागू गर्न नयाँ प्रोटीन अनुमान र वर्गीकरण एनोटेशन रणनीतिहरू विकास गर्न आवश्यक छ।

संक्षेपमा, एक उदीयमान माइक्रोबायोम अनुसन्धान प्रविधिको रूपमा, मेटाप्रोटोमिक्स टेक्नोलोजीले महत्त्वपूर्ण अनुसन्धान नतिजाहरू हासिल गरेको छ र ठूलो विकास क्षमता पनि छ।