यस लेखले कसरी तरल क्रोमेटोग्राफी स्तम्भ छनौट गर्ने भनेर सिकाउँछ

तरल क्रोमेटोग्राफी कच्चा माल, मध्यवर्ती, तयारी र प्याकेजिङ्ग सामग्रीमा प्रत्येक घटकको सामग्री र अशुद्धता परीक्षण गर्ने मुख्य विधि हो, तर धेरै पदार्थहरूमा भर पर्न मानक विधिहरू छैनन्, त्यसैले नयाँ विधिहरू विकास गर्न अपरिहार्य छ। तरल चरण विधिहरूको विकासमा, क्रोमेटोग्राफिक स्तम्भ तरल क्रोमेटोग्राफीको मूल हो, त्यसैले उपयुक्त क्रोमेटोग्राफिक स्तम्भ कसरी छनौट गर्ने महत्त्वपूर्ण छ। यस लेखमा, लेखकले तीन पक्षहरूबाट कसरी तरल क्रोमेटोग्राफी स्तम्भ छनौट गर्ने भनेर व्याख्या गर्नेछन्: समग्र विचारहरू, विचारहरू र अनुप्रयोगको दायरा।

A. तरल क्रोमेटोग्राफी स्तम्भहरू चयन गर्नका लागि समग्र विचारहरू

1. विश्लेषकको भौतिक र रासायनिक गुणहरू मूल्याङ्कन गर्नुहोस्: जस्तै रासायनिक संरचना, घुलनशीलता, स्थिरता (जस्तै कि यो अक्सिडाइज्ड / घटाउन / हाइड्रोलाइज्ड गर्न सजिलो छ), अम्लता र क्षारीयता, आदि, विशेष गरी रासायनिक संरचना कुञ्जी हो। गुणहरू निर्धारण गर्ने कारक, जस्तै संयुग्मित समूहमा बलियो पराबैंगनी अवशोषण र बलियो प्रतिदीप्ति छ;

2. विश्लेषणको उद्देश्य निर्धारण गर्नुहोस्: उच्च विभाजन, उच्च स्तम्भ दक्षता, छोटो विश्लेषण समय, उच्च संवेदनशीलता, उच्च दबाव प्रतिरोध, लामो स्तम्भ जीवन, कम लागत, आदि आवश्यक छ कि छैन;

1. उपयुक्त क्रोमेटोग्राफिक स्तम्भ छनोट गर्नुहोस्: क्रोमेटोग्राफिक फिलरको संरचना, भौतिक र रासायनिक गुणहरू बुझ्नुहोस्, जस्तै कण आकार, छिद्र आकार, तापमान सहिष्णुता, पीएच सहिष्णुता, विश्लेषकको अवशोषण, आदि।

1. तरल क्रोमेटोग्राफी स्तम्भहरू चयन गर्नका लागि विचारहरू

यस अध्यायले क्रोमेटोग्राफी स्तम्भको भौतिक र रासायनिक गुणहरूको परिप्रेक्ष्यबाट क्रोमेटोग्राफी स्तम्भ चयन गर्दा विचार गर्नुपर्ने कारकहरू छलफल गर्नेछ। २.१ फिलर म्याट्रिक्स

२.१.१ सिलिका जेल म्याट्रिक्स अधिकांश तरल क्रोमेटोग्राफी स्तम्भहरूको फिलर म्याट्रिक्स सिलिका जेल हो। यस प्रकारको फिलरमा उच्च शुद्धता, कम लागत, उच्च मेकानिकल बल छ, र समूहहरू परिमार्जन गर्न सजिलो छ (जस्तै फिनाइल बन्डिङ, एमिनो बन्डिङ, साइनो बन्डिङ, इत्यादि), तर यसले सहन सक्ने पीएच मान र तापमान दायरा सीमित छ: धेरै जसो सिलिका जेल म्याट्रिक्स फिलरहरूको pH दायरा 2 देखि 8 सम्म हुन्छ, तर विशेष रूपमा परिमार्जित सिलिका जेल बन्डेड चरणहरूको pH दायरा 1.5 देखि 10 सम्म चौडा हुन सक्छ, र त्यहाँ विशेष रूपमा परिमार्जित सिलिका जेल बन्डेड चरणहरू पनि छन् जुन कम pH मा स्थिर छन्, जस्तै Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, जुन pH 1 देखि 8 मा स्थिर छ; सिलिका जेल म्याट्रिक्सको माथिल्लो तापमान सीमा सामान्यतया 60 ℃ हुन्छ, र केहि क्रोमेटोग्राफी स्तम्भहरूले उच्च pH मा 40 ℃ को तापमान सहन सक्छ।

2.1.2 पोलिमर म्याट्रिक्स पोलिमर फिलरहरू प्रायः पोलिस्टेरिन-डिभिनिलबेन्जिन वा पोलिमेथाक्रिलेट हुन्। तिनीहरूका फाइदाहरू हुन् कि तिनीहरूले फराकिलो पीएच दायरा सहन सक्छन् - तिनीहरू 1 देखि 14 को दायरामा प्रयोग गर्न सकिन्छ, र तिनीहरू उच्च तापमानमा बढी प्रतिरोधी हुन्छन् (80 डिग्री सेल्सियस भन्दा माथि पुग्न सक्छ)। सिलिका-आधारित C18 फिलरको तुलनामा, यस प्रकारको फिलरसँग बलियो हाइड्रोफोबिसिटी हुन्छ, र म्याक्रोपोरस पोलिमर प्रोटिन जस्ता नमूनाहरू अलग गर्न धेरै प्रभावकारी हुन्छ। यसको बेफाइदाहरू यो हो कि स्तम्भ दक्षता कम छ र मेकानिकल बल सिलिका-आधारित फिलरहरूको भन्दा कमजोर छ। 2.2 कण आकार

अधिकांश आधुनिक HPLC फिलरहरू गोलाकार कणहरू हुन्, तर कहिलेकाहीं तिनीहरू अनियमित कणहरू हुन्। गोलाकार कणहरूले कम स्तम्भ दबाब, उच्च स्तम्भ दक्षता, स्थिरता र लामो जीवन प्रदान गर्न सक्छ; उच्च चिपचिपाहट मोबाइल चरणहरू (जस्तै फस्फोरिक एसिड) प्रयोग गर्दा वा नमूना समाधान चिपचिपा हुँदा, अनियमित कणहरूको ठूलो विशिष्ट सतह क्षेत्र हुन्छ, जुन दुई चरणहरूको पूर्ण कार्यको लागि अधिक अनुकूल हुन्छ, र मूल्य अपेक्षाकृत कम हुन्छ। 2.3 कण आकार

कण आकार सानो, स्तम्भ दक्षता उच्च र उच्च विभाजन, तर खराब उच्च दबाव प्रतिरोध। सबैभन्दा सामान्य रूपमा प्रयोग गरिएको स्तम्भ 5 μm कण आकार स्तम्भ हो; यदि विभाजन आवश्यकता उच्च छ भने, 1.5-3 μm फिलर चयन गर्न सकिन्छ, जुन केहि जटिल म्याट्रिक्स र बहु-घटक नमूनाहरूको विभाजन समस्या समाधान गर्न अनुकूल छ। UPLC ले 1.5 μm फिलरहरू प्रयोग गर्न सक्छ; 10 μm वा ठूला कण आकार फिलरहरू प्राय: अर्ध-तयारी वा तयारी स्तम्भहरूको लागि प्रयोग गरिन्छ। 2.4 कार्बन सामग्री

कार्बन सामग्रीले सिलिका जेलको सतहमा बन्डेड चरणको अनुपातलाई जनाउँछ, जुन विशिष्ट सतह क्षेत्र र बन्डेड चरण कभरेजसँग सम्बन्धित छ। उच्च कार्बन सामग्रीले उच्च स्तम्भ क्षमता र उच्च रिजोल्युसन प्रदान गर्दछ, र प्राय: जटिल नमूनाहरूको लागि प्रयोग गरिन्छ जसलाई उच्च विभाजन आवश्यक पर्दछ, तर दुई चरणहरू बीचको लामो अन्तरक्रियाको कारणले गर्दा, विश्लेषण समय लामो हुन्छ; कम कार्बन सामग्री क्रोमेटोग्राफिक स्तम्भहरूमा छोटो विश्लेषण समय हुन्छ र विभिन्न चयनशीलताहरू देखाउन सक्छ, र प्रायः सरल नमूनाहरूको लागि प्रयोग गरिन्छ जसलाई द्रुत विश्लेषण र उच्च जलीय चरण अवस्थाहरू आवश्यक पर्ने नमूनाहरू। सामान्यतया, C18 को कार्बन सामग्री 7% देखि 19% सम्म हुन्छ। 2.5 छिद्र आकार र विशिष्ट सतह क्षेत्र

HPLC शोषण मिडिया छिद्रपूर्ण कणहरू हुन्, र धेरै अन्तरक्रियाहरू छिद्रहरूमा हुन्छन्। त्यसकारण, अणुहरू अवशोषित र अलग हुनको लागि छिद्रहरूमा प्रवेश गर्नुपर्छ।

छिद्र आकार र विशिष्ट सतह क्षेत्र दुई पूरक अवधारणाहरू हुन्। सानो छिद्र आकारको अर्थ ठूलो विशिष्ट सतह क्षेत्र, र यसको विपरित। ठूलो विशिष्ट सतह क्षेत्रले नमूना अणुहरू र बन्डेड चरणहरू बीचको अन्तरक्रिया बढाउन सक्छ, अवधारण बढाउन सक्छ, नमूना लोडिङ र स्तम्भ क्षमता बढाउन सक्छ, र जटिल घटकहरूको विभाजन। पूर्ण रूपमा छिद्रपूर्ण फिलरहरू यस प्रकारका फिलरहरूसँग सम्बन्धित छन्। उच्च पृथक्करण आवश्यकताहरू भएकाहरूका लागि, ठूलो विशिष्ट सतह क्षेत्रको साथ फिलरहरू छनौट गर्न सिफारिस गरिन्छ; सानो विशिष्ट सतह क्षेत्रले ब्याक प्रेसर कम गर्न सक्छ, स्तम्भ दक्षता सुधार गर्न सक्छ, र सन्तुलन समय कम गर्न सक्छ, जुन ग्रेडियन्ट विश्लेषणको लागि उपयुक्त छ। कोर-शेल फिलरहरू यस प्रकारका फिलरहरूसँग सम्बन्धित छन्। विभाजन सुनिश्चित गर्ने आधारमा, उच्च विश्लेषण दक्षता आवश्यकताहरू भएकाहरूको लागि सानो विशिष्ट सतह क्षेत्रको साथ फिलरहरू छनौट गर्न सिफारिस गरिन्छ। 2.6 छिद्र भोल्युम र मेकानिकल बल

पोर भोल्युम, जसलाई "पोर भोल्युम" पनि भनिन्छ, प्रति एकाइ कण शून्य भोल्युमको आकारलाई बुझाउँछ। यसले फिलरको मेकानिकल बललाई राम्रोसँग प्रतिबिम्बित गर्न सक्छ। ठूलो पोर भोल्युम भएका फिलरहरूको मेकानिकल बल सानो छिद्र भोल्युम भएको फिलरहरूको भन्दा थोरै कमजोर हुन्छ। 1.5 mL/g भन्दा कम वा बराबर पोर भोल्युम भएका फिलरहरू प्रायः HPLC पृथकीकरणको लागि प्रयोग गरिन्छ, जबकि 1.5 mL/g भन्दा बढी पोर भोल्युम भएका फिलरहरू मुख्यतया आणविक बहिष्कार क्रोमाटोग्राफी र कम-प्रेशर क्रोमाटोग्राफीको लागि प्रयोग गरिन्छ। 2.7 क्यापिङ दर

क्यापिङले यौगिकहरू र खुला सिलानोल समूहहरू (जस्तै क्षारीय यौगिकहरू र सिलानोल समूहहरू बीचको आयनिक बन्धन, भ्यान डर वाल्स बलहरू र एसिडिक यौगिकहरू र सिलानोल समूहहरू बीचको हाइड्रोजन बन्डहरू) बीचको अन्तरक्रियाको कारणले गर्दा हुने टेलिङ पीकहरू कम गर्न सक्छ, जसले गर्दा स्तम्भको दक्षता र शिखर आकारमा सुधार हुन्छ। । अनक्याप गरिएको बन्डेड चरणहरूले विशेष गरी ध्रुवीय नमूनाहरूका लागि क्याप्ड बन्डेड चरणहरूको सापेक्ष विभिन्न छनौटहरू उत्पादन गर्दछ।

1. विभिन्न तरल क्रोमैटोग्राफी स्तम्भहरूको आवेदन दायरा

यस अध्यायले केही केसहरू मार्फत विभिन्न प्रकारका तरल क्रोमेटोग्राफी स्तम्भहरूको आवेदन दायरा वर्णन गर्नेछ।

3.1 उल्टो चरण C18 क्रोमेटोग्राफिक स्तम्भ

C18 स्तम्भ सबैभन्दा सामान्य रूपमा प्रयोग हुने रिभर्स्ड-फेज स्तम्भ हो, जसले धेरैजसो जैविक पदार्थहरूको सामग्री र अशुद्धता परीक्षणहरू पूरा गर्न सक्छ, र मध्यम-ध्रुवीय, कमजोर ध्रुवीय र गैर-ध्रुवीय पदार्थहरूमा लागू हुन्छ। C18 क्रोमेटोग्राफिक स्तम्भको प्रकार र विशिष्टता विशिष्ट विभाजन आवश्यकताहरू अनुसार चयन गरिनु पर्छ। उदाहरण को लागी, उच्च पृथक आवश्यकताहरु संग पदार्थहरु को लागी, 5 μm * 4.6 mm * 250 mm विशिष्टताहरु अक्सर प्रयोग गरिन्छ; जटिल विभाजन matrices र समान ध्रुवता भएका पदार्थहरूको लागि, 4 μm*4.6 mm*250 mm विशिष्टता वा सानो कण आकारहरू प्रयोग गर्न सकिन्छ। उदाहरणका लागि, लेखकले celecoxib API मा दुई genotoxic अशुद्धता पत्ता लगाउन 3 μm*4.6 mm*250 mm स्तम्भ प्रयोग गर्नुभयो। दुई पदार्थको विभाजन 2.9 पुग्न सक्छ, जुन उत्कृष्ट छ। थप रूपमा, विभाजन सुनिश्चित गर्ने आधारमा, यदि द्रुत विश्लेषण आवश्यक छ भने, 10 मिमी वा 15 मिमीको छोटो स्तम्भ प्रायः चयन गरिन्छ। उदाहरणका लागि, जब लेखकले LC-MS/MS को पाइपराक्वाइन फस्फेट API मा genotoxic अशुद्धता पत्ता लगाउन प्रयोग गरे, 3 μm*2.1 mm*100 mm स्तम्भ प्रयोग गरियो। अशुद्धता र मुख्य कम्पोनेन्ट बीचको विभाजन 2.0 थियो, र नमूना पत्ता लगाउन 5 मिनेटमा पूरा गर्न सकिन्छ। 3.2 उल्टो चरण फिनाइल स्तम्भ

फिनाइल स्तम्भ पनि उल्टो चरण स्तम्भ को एक प्रकार हो। यस प्रकारको स्तम्भमा सुगन्धित यौगिकहरूको लागि बलियो चयनता छ। यदि सामान्य C18 स्तम्भ द्वारा मापन गरिएको सुगन्धित यौगिकहरूको प्रतिक्रिया कमजोर छ भने, तपाइँ फिनाइल स्तम्भ प्रतिस्थापन गर्न विचार गर्न सक्नुहुन्छ। उदाहरणका लागि, जब मैले celecoxib API बनाइरहेको थिएँ, उही निर्माताको फिनाइल स्तम्भ र उही विशिष्टता (सबै 5 μm*4.6 mm*250 mm) द्वारा मापन गरिएको मुख्य घटक प्रतिक्रिया C18 स्तम्भको लगभग 7 गुणा थियो। 3.3 सामान्य-चरण स्तम्भ

उल्टो-चरण स्तम्भको प्रभावकारी पूरकको रूपमा, सामान्य-चरण स्तम्भ उच्च ध्रुवीय यौगिकहरूको लागि उपयुक्त छ। यदि उल्टो-फेज स्तम्भमा 90% भन्दा बढी जलीय चरणको साथ एल्युट गर्दा शिखर अझै छिटो छ, र सोल्भेन्ट शिखरको नजिक र ओभरल्याप पनि छ भने, तपाइँ सामान्य-चरण स्तम्भ प्रतिस्थापन गर्न विचार गर्न सक्नुहुन्छ। यस प्रकारको स्तम्भमा हिलिक स्तम्भ, एमिनो स्तम्भ, साइनो स्तम्भ, आदि समावेश छन्।

3.3.1 हिलिक स्तम्भ हिलिक स्तम्भले ध्रुवीय पदार्थहरूको प्रतिक्रिया बढाउनको लागि बन्डेड एल्काइल श्रृंखलामा हाइड्रोफिलिक समूहहरूलाई सामान्यतया इम्बेड गर्दछ। यस प्रकारको स्तम्भ चिनी पदार्थहरूको विश्लेषणको लागि उपयुक्त छ। जाइलोज र यसको डेरिभेटिभहरूको सामग्री र सम्बन्धित पदार्थहरू गर्दा लेखकले यस प्रकारको स्तम्भ प्रयोग गरे। एक xylose व्युत्पन्न को isomers पनि राम्रोसँग अलग गर्न सकिन्छ;

३.३.२ एमिनो स्तम्भ र साइनो स्तम्भ एमिनो स्तम्भ र साइनो स्तम्भले बन्डेड एल्काइल श्रृंखलाको अन्त्यमा क्रमशः एमिनो र साइनो परिमार्जनहरूको परिचयलाई जनाउँछ, विशेष पदार्थहरूको लागि चयनशीलता सुधार गर्न: उदाहरणका लागि, एमिनो स्तम्भ एक राम्रो विकल्प हो। चिनी, एमिनो एसिड, बेस, र एमाइड्स को विभाजन को लागी; संयुग्मित बन्डहरूको उपस्थितिको कारण हाइड्रोजनेटेड र गैर-हाइड्रोजनरहित संरचनात्मक समान पदार्थहरू छुट्याउँदा साइनो स्तम्भमा राम्रो चयनशीलता हुन्छ। एमिनो स्तम्भ र सायनो स्तम्भ प्रायः सामान्य चरण स्तम्भ र उल्टो चरण स्तम्भ बीच स्विच गर्न सकिन्छ, तर बारम्बार स्विच गर्न सिफारिस गरिएको छैन। ३.४ चिरल स्तम्भ

Chiral स्तम्भ, नामले सुझाव दिन्छ, चिरल यौगिकहरूको विभाजन र विश्लेषणको लागि उपयुक्त छ, विशेष गरी औषधिको क्षेत्रमा। यस प्रकारको स्तम्भलाई विचार गर्न सकिन्छ जब परम्परागत उल्टो चरण र सामान्य चरण स्तम्भहरूले आइसोमरहरूको विभाजन हासिल गर्न सक्दैनन्। उदाहरणका लागि, लेखकले 1,2-diphenylethylenediamine: (1S, 2S)-1, 2-diphenylethylenediamine र (1R, 2R)-1, 2 को दुई आइसोमरहरू अलग गर्न 5 μm*4.6 mm*250 mm काइरल स्तम्भ प्रयोग गर्नुभयो। -डिफेनिलेथिलेनेडियामिन, र दुई बीचको विभाजन लगभग 2.0 पुग्यो। यद्यपि, काइरल स्तम्भहरू अन्य प्रकारका स्तम्भहरू भन्दा महँगो हुन्छन्, सामान्यतया 1W+/piece। यदि त्यस्ता स्तम्भहरूको आवश्यकता छ भने, एकाइले पर्याप्त बजेट बनाउन आवश्यक छ। 3.5 आयन विनिमय स्तम्भ

आयन एक्सचेन्ज स्तम्भहरू चार्ज गरिएको आयनहरू, जस्तै आयनहरू, प्रोटीनहरू, न्यूक्लिक एसिडहरू, र केही चिनी पदार्थहरूको विभाजन र विश्लेषणको लागि उपयुक्त छन्। फिलर प्रकारका अनुसार, तिनीहरू क्यासन एक्सचेन्ज स्तम्भहरू, एनियन एक्सचेन्ज स्तम्भहरू, र बलियो क्यासन विनिमय स्तम्भहरूमा विभाजित छन्।

क्यासन एक्सचेन्ज स्तम्भहरूले क्याल्सियम-आधारित र हाइड्रोजन-आधारित स्तम्भहरू समावेश गर्दछ, जुन मुख्यतया एमिनो एसिड जस्ता क्याशनिक पदार्थहरूको विश्लेषणको लागि उपयुक्त हुन्छ। उदाहरणका लागि, लेखकले क्याल्सियम ग्लुकोनेट र क्याल्सियम एसीटेटलाई फ्लशिङ समाधानमा विश्लेषण गर्दा क्याल्सियम-आधारित स्तम्भहरू प्रयोग गरे। दुबै पदार्थको λ=210nm मा कडा प्रतिक्रिया थियो, र विभाजन डिग्री 3.0 पुग्यो; लेखकले ग्लुकोज-सम्बन्धित पदार्थहरूको विश्लेषण गर्दा हाइड्रोजन-आधारित स्तम्भहरू प्रयोग गरे। धेरै प्रमुख सम्बन्धित पदार्थहरू - माल्टोज, माल्टोट्रिओज र फ्रक्टोज - डिफरेंशियल डिटेक्टरहरू अन्तर्गत उच्च संवेदनशीलता थियो, पत्ता लगाउने सीमा ०.५ पीपीएम र 2.0-2.5 को विभाजन डिग्री।

आयन विनिमय स्तम्भहरू मुख्यतया जैविक एसिड र हलोजन आयनहरू जस्ता anionic पदार्थहरूको विश्लेषणको लागि उपयुक्त छन्; बलियो क्याशन एक्सचेन्ज स्तम्भहरूमा उच्च आयन विनिमय क्षमता र चयनशीलता हुन्छ, र जटिल नमूनाहरूको विभाजन र विश्लेषणको लागि उपयुक्त हुन्छ।

माथिका धेरै सामान्य तरल क्रोमेटोग्राफी स्तम्भहरूको प्रकार र अनुप्रयोग दायराहरूको परिचय मात्र हो लेखकको आफ्नै अनुभवको साथ। वास्तविक अनुप्रयोगहरूमा क्रोमेटोग्राफिक स्तम्भहरूका अन्य विशेष प्रकारहरू छन्, जस्तै ठूलो-छिद्र क्रोमेटोग्राफिक स्तम्भहरू, सानो-छिद्र क्रोमेटोग्राफिक स्तम्भहरू, एफिनिटी क्रोमेटोग्राफी स्तम्भहरू, बहुमोड क्रोमेटोग्राफिक स्तम्भहरू, अल्ट्रा-उच्च प्रदर्शन लिक्विड क्रोमेटोग्राफी (उल्ट्रा-हाई प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी)। SFC), आदि तिनीहरूले विभिन्न क्षेत्रमा महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छन्। विशिष्ट प्रकारको क्रोमेटोग्राफिक स्तम्भ नमूनाको संरचना र गुणहरू, विभाजन आवश्यकताहरू र अन्य उद्देश्यहरू अनुसार चयन गरिनु पर्छ।